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      介紹酵母雙雜交的兩種構(gòu)建方法

      更新時(shí)間:2021-07-27   點(diǎn)擊次數(shù):2982次
        酵母雙雜交技術(shù)作為研究蛋白質(zhì)相互作用的主要方法,在規(guī)模化蛋白質(zhì)相互作用研究中占據(jù)舉足輕重的地位,已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要實(shí)驗(yàn)手段,因此有不少生物公司提供從構(gòu)建雜交文庫(kù)到文庫(kù)篩選的一站式酵母雙雜交服務(wù)。但是酵母雙雜交技術(shù)的分子生物學(xué)操作是比較復(fù)雜的,包含從基因的載體構(gòu)建、蛋白質(zhì)的自激活檢測(cè)到多次酵母轉(zhuǎn)化和相互作用的確認(rèn),對(duì)酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),可以提高其工作效率。
        目前市場(chǎng)上提供的酵母雙雜交服務(wù)有核體系和膜體系兩種,酵母雙雜交與其他相互作用篩選手段相比,最大的優(yōu)勢(shì)在于它能夠適應(yīng)基因組水平的高通量篩選。美迪西提供酵母雙雜交服務(wù),其具有獨(dú)立優(yōu)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室和專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員,提供詳細(xì)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)步驟、原始數(shù)據(jù)和圖片、結(jié)果分析,可以出具檢測(cè)數(shù)據(jù)報(bào)告。
        為了降低工作量使其更適用于高通量篩選,需要對(duì)酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),常采用的手段有酵母雙雜交陣列篩選技術(shù)和規(guī)模化載體構(gòu)建方法。
        1、酵母雙雜交陣列篩選技術(shù)
        從傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的酵母雙雜交文庫(kù)篩選技術(shù)能夠支持一個(gè)誘餌與整個(gè)cDNA文庫(kù)的篩選,可以用于篩選一個(gè)蛋白質(zhì)與整個(gè)cDNA文庫(kù)中的相互作用。但是該技術(shù)并不適用于基因組水平的相互作用篩選。
        首先,基因組水平的相互作用篩選需要成千上萬(wàn)的誘餌,而對(duì)這些誘餌進(jìn)行文庫(kù)篩選工作量極大;其次,由于cDNA片段不同,篩選過(guò)程中呈劣勢(shì)生長(zhǎng)的菌株不容易得到篩選;最后篩庫(kù)同樣面臨單次篩選只能獲得文庫(kù)中極少部分的相互作用結(jié)果。為了適應(yīng)基因組水平的相互作用篩選,人們開(kāi)發(fā)了酵母雙雜交陣列篩選技術(shù)。
        陣列篩選法又可分為一對(duì)一陣列、高通量陣列法、亞庫(kù)對(duì)亞庫(kù)法。一對(duì)一陣列法含有不同BD-X的菌株和所有含不同AD-Y的菌株一一對(duì)應(yīng)篩選。
        高通量陣列法是把所有不同ORF-AD集合成庫(kù),然后與排成陣列的不同BD-X作用的篩選方法,其實(shí)質(zhì)是誘餌數(shù)量較大情況下的陣列化文庫(kù)篩選。亞庫(kù)對(duì)亞庫(kù)法把總數(shù)較大的DBD-X和AD-Y的成員分別編號(hào)并分組,每組含一定數(shù)量的成員,然后集合每組成員形成亞庫(kù)(pool),再用獵物亞庫(kù)對(duì)誘餌亞庫(kù)一一作用,篩選陽(yáng)性克隆。此法工作量大,獲得的陽(yáng)性克隆的獵物和誘餌都需測(cè)序鑒定。
        2、規(guī)模化載體構(gòu)建方法
        規(guī)模化酵母雙雜交篩選需要構(gòu)建大量的表達(dá)載體,因此載體構(gòu)建工作的質(zhì)量和速度對(duì)于后續(xù)的酵母雙雜交篩選至關(guān)重要。傳統(tǒng)的構(gòu)建載體的方法是限制酶切-連接方法,可以有效地將目的片段插入載體,然而其操作時(shí)間長(zhǎng),需要酶切、連接兩步反應(yīng),構(gòu)建成功后的重組質(zhì)粒需要進(jìn)行DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證其正確性,表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中存在載體自連、連接困難等缺點(diǎn),這些缺點(diǎn)使得限制酶切-連接方法不能用于高通量的載體構(gòu)建。

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